바이러스 핵산 검출

대부분의 바이러스의 게놈 서열은 알려져 있습니다.상보적인 바이러스 DNA 또는 RNA 단편과 혼성화하도록 설계된 DNA의 짧은 단편인 핵산 프로브.중합효소연쇄반응(PCR)은 바이러스 검출을 위한 보다 효율적인 기술입니다.높은 처리량 진단 방법이 최근에 개발되었습니다.

A. 핵산 혼성화 기술

주로 Southern blotting(Southern)과 Northern blotting(Northern)을 포함한 핵산 혼성화는 바이러스 진단 분야에서 빠르게 발전하고 있는 새로운 기술입니다.혼성화 분석의 근거는 상보적인 바이러스 DNA 또는 RNA 분절과 혼성화하도록 설계된 짧은 DNA 분절("프로브"라고 함)을 사용하는 것입니다.가열 또는 알칼리 처리에 의해 이중 가닥의 표적 DNA 또는 RNA가 단일 가닥으로 분리된 후 고체 지지체에 고정됩니다.그 후, 프로브가 추가되어 표적 DNA 또는 RNA와 혼성화됩니다.프로브는 동위원소 또는 비방사성 핵종으로 표지되어 있으므로 autoradiography 또는 biotin-avidin 시스템을 통해 표적 DNA 또는 RNA를 검출할 수 있습니다.대부분의 바이러스 게놈은 복제되고 시퀀싱되었기 때문에 바이러스 특이적 염기서열을 표본에서 프로브로 사용하여 탐지할 수 있습니다.현재, 혼성화 방법에는 도트 블롯, 세포 내 제자리 혼성화, DNA 블로팅(DNA)(서던 블롯) 및 RNA 블로팅(RNA)(노던 블롯)이 포함됩니다.

B.PCR 기술

최근 몇 년 동안 PCR을 기반으로 하여 둔감하거나 배양할 수 없는 바이러스를 테스트하기 위한 일련의 시험관 내 핵산 증폭 기술이 개발되었습니다.PCR은 시험관 내 중합효소 반응에 의해 특정 DNA 서열을 합성할 수 있는 방법입니다.PCR 과정은 denaturation , annealing , extension 의 3단계의 열 사이클을 포함합니다. 고온(93℃~95℃)에서 이중 가닥 DNA는 두 개의 단일 DNA 가닥으로 분리됩니다.그런 다음 저온(37℃~60℃)에서 2개의 합성 뉴클레오티드 프라이머가 상보적인 DNA 세그먼트에 어닐링됩니다.Taq 효소의 적정 온도(72℃)에서는 상보적인 DNA를 주형으로 사용하고 단일 뉴클레오티드를 재료로 사용하여 프라이머 3' 말단에서 새로운 DNA 사슬의 합성이 시작됩니다.따라서 각 주기 후에 하나의 DNA 사슬이 두 사슬로 증폭될 수 있습니다.이 과정을 반복하면 한 주기에서 합성된 각 DNA 사슬을 다음 주기의 주형으로 사용할 수 있으며, 각 주기마다 DNA 사슬의 수가 2배씩 증가하므로 PCR 생산이 2n log 속도로 증폭된다.25~30주기 후 전기영동을 통해 PCR의 생성 여부를 확인하고, 특정 DNA 산물을 자외선(254nm)에서 관찰할 수 있습니다.PCR은 특이성, 민감성 및 편의성의 장점으로 인해 HCV, HIV, CMV 및 HPV와 같은 많은 바이러스 감염의 임상 진단에 채택되었습니다.PCR은 매우 민감하므로 fg 수준에서 바이러스 DNA를 감지할 수 있으므로 위양성을 피하기 위해 작업을 매우 신중하게 수행해야 합니다.또한 핵산 검사에서 양성이라고 해서 검체에 살아있는 감염성 바이러스가 있는 것은 아닙니다.

PCR 기술의 광범위한 적용으로 다양한 테스트 목적을 위한 PCR 기술을 기반으로 하는 새로운 기술 및 방법이 개발됩니다.예를 들어, 실시간 정량적 PCR은 바이러스 부하를 감지할 수 있습니다.in situ PCR은 조직이나 세포에서 바이러스 감염을 확인하는 데 사용됩니다.Nested PCR은 PCR의 특이성을 높일 수 있습니다.그 중 real time quantitative PCR이 더욱 빠르게 발전하고 있습니다.TaqMan 가수분해 프로브, 하이브리드화 프로브 및 분자 비콘 프로브와 같은 많은 새로운 기술이 실시간 정량적 PCR 기술에 결합되어 임상 연구에서 널리 활용되고 있습니다.환자의 체액에서 바이러스 부하를 정확하게 식별하는 것 외에도 이 방법은 약물 내성 돌연변이를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다.따라서 실시간 정량 PCR은 주로 치료 효과 평가 및 약물 내성 감시에 적용됩니다.

C. 바이러스 핵산의 고처리량 검출

신종 감염병의 신속한 진단에 대한 요구를 충족시키기 위해 DNA 칩(DNA)과 같은 다양한 고처리량 검출 방법이 확립되었습니다.DNA 칩의 경우 특정 프로브를 합성하고 작은 실리콘 칩에 매우 고밀도로 부착하여 샘플과 혼성화할 수 있는 DNA 프로브 마이크로어레이(DNA)를 형성합니다.혼성화 신호는 공초점 현미경이나 레이저 스캐너로 이미지화할 수 있고 컴퓨터로 추가 처리할 수 있으며 다른 유전자에 관한 방대한 데이터 세트를 얻을 수 있습니다.DNA 칩에는 두 가지 종류가 있습니다."합성 칩"은 다음과 같습니다. 특정 올리고뉴클레오티드는 칩에서 직접 합성됩니다.다른 하나는 DNA 풀 칩입니다.복제된 유전자 또는 PCR 산물이 슬라이드에 순서대로 인쇄됩니다.DNA 칩 기술의 장점은 방대한 양의 DNA 염기서열을 동시에 검출할 수 있다는 점입니다.최신 버전의 병원체 탐지 칩은 1700개 이상의 인간 바이러스를 한 번에 식별할 수 있습니다.DNA 칩 기술은 기존의 핵산 혼성화 방법의 문제를 해결했으며 바이러스 진단 및 역학 연구에 매우 광범위하게 적용됩니다.